Molecular Cloning
Pada berbagai macam eksperimen yang berkaitan dengan dunia molekuler sel pastinya tidak akan lepas dari keberadaan dan ketersediaan DNA. Ada beberapa beberapa cara untuk memeroleh DNA dan salah satunya adalah dengan menggunakan teknik isolasi sederhana. DNA didapatkan secara langsung melalui proses pemecahan sel dan pengisolasian dengan beberapa larutan dan teknik sentrifugasi. Namun, muncul masalah saat kita ingin menggunakan fragmen DNA tertentu dalam kuantitas yang besar. Hampir tidak mungkin teknik isolasi DNA sederhana dapat memenuhi kebutuhan tersebut. Ditambah lagi kesulitan untuk dapat memilih fragmen DNA yang diinginkan.
Pada tahun 1970 ditemukanlah cara untuk dapat mengisolasi fragmen DNA yang diinginkan. Penemuan tersebut adalah enzim restriksi endonuklease. Enzim ini dapat memotong DNA hampir secara spesifik pada daerah restriksi. Akibat adanya teknologi ini, perkembangan penelitian dan aplikasi dalam dunia biologi molekuler berkembang sangat cepat. Akan tetapi, penerapan teknologi ini saja belum cukup untuk dapat memroduksi fragmen DNA tertentu secara masal.
Molecular Cloning dapat menjadi salah satu metode pilihan untuk dapat menghasilkan fragmen DNA spesifik dalam kuantitas yang besar. Molecular Cloning adalah suatu kumpulan metode biologi molekuler yang digunakan untuk menyusun suatu DNA rekombinan yang direplikasi dalam suatu organisme inang(Lessard, 2013). Kumpulan set metode Molecular Cloning meliputi langkah berikut.
1. Isolasi dari target fragmen DNA (sering kali disebut Inserts).
2. Ligasi dari inserts ke pada suatu vektor dan menciptakan molekul rekombinan.
3. Trasnformasi dari plasmid rekombinan kedalam suatu bakteria atau inang lain yang cocok.
4. Screening/seleksi dari inang yang mengandung plasmid rekombinan.
Isolasi fragment DNA dapat didapatkan melalui proses pencernaan potongan DNA yang telah ada oleh enzim restriksi dan penargetan via PCR. Setelah berhasil melalui proses isolasi, fragmen DNA yang diinginkan akan diligasi pada vektor plasmid, potongan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler. Plasmid yang digunakan dalam metode kali ini memiliki perbedaan dengan plasmid yang biasa ditemui di alam. Plasmid alami memiliki ukuran yang lebih besar dengan plasmid yang digunakan. Plasmid yang digunakan tetap memiliki beberapa bagian dasar seperti origin of replication, drug-resistance gene, dan situs restriksi unik yang memfasilitasi insersi dari fragmen DNA. Sering kali, terdapat beberapa situs restriksi yang dikelompokan bersama dan mempermudah pemilihan dari enzim restriksi dan kombinasi dari inserts(Lessard, 2013).
Gambar 1. Langkah Molecular Cloning
(Tirabassi, 2014)
Pemilihan dari jenis enzim restriksi sangat penting dalam pemodelan plasmid. Saat proses pemotongan lansung dari DNA terjadi sehingga terbentuk potongan rapi dengan basa nitrogen pada ujung potongan tetap memiliki pasangan, ujung ini disebut dengan blunt ends. Bila pemotongan DNA menyisakan ujung dengan basa nitrogen yang menggantung tanpa pasangan, ujung ini disebut dengan sticky end, karena sifatnya yang mudah mencari pasangan dan meningkatkan efisiensi proses ligasi. Proses ligasi ini akan dibantu dengan enzim ligase.
Setelah plasmid selesai dibuat, vektor akan dimasukan kedalam inang. Beberapa inang akan menerima vektor. Proses tersebutlah yang yang disebut dengan transformasi. Proses ini dapat dibantu dengan menggunakan metode elektroporasi yang akan meningkatkan kemampuan inang untuk menerima plasmid. Inang yang menerima plasmid juga akan menerima kemampuan resistensi terhadap antibiotik. Oleh karena itu terdapat sebuah proses yang dinamakan proses screening. Proses ini adalah pemaparan antibiotik tertentu pada kultur. Inang yang tidak membawa plasmid akan mati dikarenakan kekurangan gen resisten antibiotik. Pada akhirnya, kultur akan menyisakan inang yang hanya membawa plasmid dan fragmen DNA yang kita inginkan. Setelah itu inang dapat kita kultur hingga jumlah yang diinginkan dan selanjutnya dapat diisolasi.
